3CB Biochemische analyse: theorie en lab

Uit Diana's examenwiki

EIWITTECHNOLOGIE JANUARI 2017

Vraag 1

Een mengsel eiwitten gegeven, met van elk eiwit de AZ samenstelling, hittebestendigheid, oplobaarheid in (NH4)2SO4, hydrofobiciteit en al dan niet aanwezigheid van een MBP tag gegeven.

a) Op welke manier zou jij een eiwit uit dit mengsel opzuiveren? Motiveer je keuze. Wat gebeurt er tijdens de verschillende stappen met de eiwitten.

b) Indien je zuivere oplossingen zou krijgen die enkel eiwit A, enkel eiwit B, enkel eiwit C, enz. bevat, kan je dan aan de hand van één ijklijn van de absorbanties bij 280nm de concentraties van de zuivere eiwitten in de oplossing te weten komen?

Indien wel: verklaar. Indien niet: verklaar en leg uit welke hoe het beter zou kunnen. (Antw.: Nee. Absorbantie bij 280nm is afhankelijk van aromatische aminozuren en is dus afhankelijk van de samenstelling van een eiwit. Beter wordt de biureetreactie toegepast waarbij alleen het aantal peptidebindingen verantwoordelijk is voor de kleuring. Deze absorbantiemeting zal dus niet afhankelijk zijn van de AZ samenstelling.)

C) Wat is de MBP tag? Geef twee toepassingen voor deze tag.


Vraag 2

Een chromatogram van IEC gegeven waarop de curves van 3 verschillende eiwitten gegeven zijn in functie van de pH van de kolom.

A) Waarvoor en wanneer wordt deze techniek gebruikt?

B) Duidt de positieve en de negatieve pool aan op de tekening zoals het op de kolom zou zijn in deze situatie.

C) Twee lege grafieken gegeven voor een pH A waarbij eiwit 1 zijn pI al is gepasseerd en eiwit 2 en 3 nog niet en voor een pH B waar alledrie de eiwitten hun pI al zijn gepasseerd. Ook is het verloop van een elutie met stijgende zoutconcentratie getekend op de grafieken.

Teken de drie pieken van de eiwitten in functie van de stijgende zoutconcentratie bij die pH.


Vraag 3

Een chromatogram wordt gegeven met daarnaast gegevens over startbuffer, elutiebuffer en de eiwitten waarvan de pieken zichtbaar zijn.

Met welke techniek kwam dit chromatogram tot stand? Waaruit kan je dat afleiden? (Antw.: HIC want er wordt gestart bij hoge [zout] en geëlueerd bij lage [zout].)

Bespreek hoe de elutie gebeurt bij dit soort chromatografie en op welke manier juist de eiwitten loskomen van de kolom.

Als er Triton-X-140 (0,2%) wordt toegevoegd, welk effect heeft dit dan op de elutiepieken?


Vraag 4

Wat is de GST tag?

Bij welke soort chromatografie wordt de GST tag gebruikt?

Bespreek de performantieparameters van dit soort chromatografie. Wanneer kan je deze techniek het beste gebruiken?


Vraag 5 Situeer volgende begrippen:

Natieve gelelektroforese

...


EIWITTECHNOLOGIE JANUARI 2016

VRAAG 1

Een mengsel bevat zes eiwitten (A – B – C – D – E – F) waarbij van elk eiwit gegeven is:

- moleculair gewicht - oplosbaarheid in (NH4)2SO4 - aantal Glu, Asp, Arg en Lys - hydrofobiciteit t.o.v. elkaar - hittegevoeligheid - aanwezigheid van N-terminale GST-tag

a. Alle toestellen, materialen en chemicaliën uit een goed uitgerust eiwitlabo zijn ter beschikking. Op welke manier zou jij eiwit E uit dit mengsel opzuiveren? Bespreek en motiveer de procedure die je volgt (materiaal, reagentia, waarom deze stap). Wat gebeurt er met de eiwitten in elke stap?

b. Schat het totaal aantal aminozuren waaruit eiwit A bestaat.

c. Hoe wordt het aantal lysines in een eiwit bepaald?


VRAAG 2

Een procedure om fosfatase-enzyme te zuiveren bestaat uit vier stappen. Er is een (onvolledige) purificatietabel gegeven.

a. Wanneer en waarom wordt een purificatietabel opgesteld?

b. Vul de tabel aan (specifieke activiteit, rendement en purificatiefactor)

c. Wat is specifieke activiteit en wat is de eenheid?

d. Bespreek één colorimetrische en één niet-colorimetrische techniek om de eiwitconcentratie te bepalen (benoem, leg uit, voor- en nadelen).

e. Geef vier mogelijke redenen waarom de totale activiteit daalt.


VRAAG 3

Er is een chromatogram gegeven van een mengsel van drie gelijkaardige enzymen: het enzyme zelf, identiek enzyme met deletie van een aantal terminale aminozuren en identiek enzyme met een andere tertiaire structuur.

a. Welk soort chromatografie? Waaruit kan je dit afleiden?

b. Wat is het effect wanneer een bepaalde component weg is?

c. Hoe kan de elutie vervroegd worden?

d. Hoe kan de resolutie verhoogd worden?

e. ?


VRAAG 4

a. Wat is His-tag?

b. Bespreek de bindings- en elutiecondities.

c. Bespreek de organisatie van de kolom.


VRAAG 5

Definieer/situeer volgende begrippen:

- MOPS - Tween20 - DEAE - ubiquinatie - natieve elektroforese - CHAPS


EIWITTECHNOLOGIE AUGUSTUS 2016

VRAAG 1

Een mengsel bevat zes eiwitten (A – B – C – D – E – F) waarbij van elk eiwit gegeven is:

- oplosbaarheid in (NH4)2SO4 - totaal aantal aminozuren - aantal Glu, Asp, Arg en Lys - hydrofobiciteit t.o.v. elkaar - hittegevoeligheid

Alle toestellen, materialen en chemicaliën uit een goed uitgerust eiwitlabo zijn ter beschikking. Op welke manier zou jij eiwit E uit dit mengsel opzuiveren? Bespreek en motiveer de procedure die je volgt (materiaal, reagentia, waarom deze stap). Wat gebeurt er met de eiwitten in elke stap?


VRAAG 2

a. Wat is de algemene structuur van een detergent?

b. Welke vier groepen detergenten bestaan er + geef een voorbeeld voor elk.

c. Geef vier typische toepassingen van detergenten in een eiwitlabo.

d. Tabel gegeven met detergenten waarin o.a. aggregatiegetal, CMC, MW, Cloud Point gegeven. Welk niet-denaturerend detergent kan je gebruiken bij de extractie van transmembraanproteïnen en kan daarna gemakkelijk verwijderd worden met dialyse?


VRAAG 3

Er is een chromatogram gegeven.

a. welk soort chromatografie? Geef twee kenmerken waaruit je dit kan afleiden.

b. Piek in chromatogram aangeduid, bevat hoofdzakelijk glucose-6-fosfatase - Hoe kan je de zuiverheid nagaan? Geef twee mogelijkheden + motiveer welke in dit geval de beste keuze zou zijn - ?

c. Hoe kan je de elutie van glucose-6-fosfatase sneller doen verlopen?


VRAAG 4

Leg uit + teken: Laemmli SDS-Page


VRAAG 5

Definieer/situeer volgende begrippen: - ? - Uitzouten - Elektogram - Ramachandranplot


VRAAG 6

Geef 1) toepassingen/gebruik 2) bindingscondities en 3) elutiemogelijkheden van - benzamidine als ligand - maltose als ligand