3LF Biomedisch onderzoek: biotechnologie

Uit Diana's examenwiki

Eiwittechnologie

EIWITTECHNOLOGIE JANUARI 2017

Vraag 1 Een mengsel eiwitten gegeven, met van elk eiwit de AZ samenstelling, oplobaarheid in (NH4)2SO4, hydrofobiciteit en al dan niet aanwezigheid van een MBP tag gegeven.

  • Op welke manier zou jij een eiwit uit dit mengsel opzuiveren? Motiveer je keuze. Wat gebeurt er tijdens de verschillende stappen met de eiwitten.
  • Indien je zuivere oplossingen zou krijgen die enkel eiwit A, enkel eiwit B, enkel eiwit C, enz. bevat, kan je dan aan de hand van één ijklijn van de absorbanties bij 280nm de concentraties van de zuivere eiwitten in de oplossing te weten komen? Indien wel: verklaar. Indien niet: verklaar en leg uit welke hoe het beter zou kunnen. (Antw.: Nee. Absorbantie bij 280nm is afhankelijk van aromatische aminozuren en is dus afhankelijk van de samenstelling van een eiwit. Beter wordt de biureetreactie toegepast waarbij alleen het aantal peptidebindingen verantwoordelijk is voor de kleuring. Deze absorbantiemeting zal dus niet afhankelijk zijn van de AZ samenstelling.)
  • Wat is de MBP tag? Geef twee toepassingen voor deze tag.

Vraag 2 Een chromatogram van IEC gegeven waarop de curves van 3 verschillende eiwitten gegeven zijn in functie van de pH van de kolom.

  • Waarvoor en wanneer wordt IEC gebruikt?
  • Duidt de positieve en de negatieve pool aan op de tekening zoals het op de kolom zou zijn in deze situatie.

Twee lege grafieken gegeven voor een pH A waarbij eiwit 1 zijn pI al is gepasseerd en eiwit 2 en 3 nog niet en voor een pH B waar alledrie de eiwitten hun pI al zijn gepasseerd. Ook is het verloop van een elutie met stijgende zoutconcentratie getekend op de grafieken.

  • Teken de drie pieken van de eiwitten in functie van de stijgende zoutconcentratie bij die pH.

Vraag 3 Een chromatogram wordt gegeven met daarnaast gegevens over startbuffer, elutiebuffer en de eiwitten waarvan de pieken zichtbaar zijn.

  • Met welke techniek kwam dit chromatogram tot stand? Waaruit kan je dat afleiden? (Antw.: HIC want er wordt gestart bij hoge [zout] en geëlueerd bij lage [zout].)
  • Bespreek hoe de elutie gebeurt bij dit soort chromatografie en op welke manier juist de eiwitten loskomen van de kolom.
  • Als er Triton-X-140 (0,2%) wordt toegevoegd, welk effect heeft dit dan op de elutiepieken?

Vraag 4

  • Wat is de GST tag?
  • Bij welke soort chromatografie wordt de GST tag gebruikt?
  • Bespreek de performantieparameters van dit soort chromatografie. Wanneer kan je deze techniek het beste gebruiken?

Vraag 5 Situeer volgende begrippen:

  • HEPES
  • Dithiotreïtol
  • Expression proteomics
  • Natieve gelelektroforese
  • (Laatste ben ik vergeten)


EIWITTECHNOLOGIE JANUARI 2015

  • Een mengsel eiwitten gegeven, met van elk eiwit de AZ samenstelling, oplosbaarheid in (NH4)2SO4 en hydrofobiciteit gegeven. Op welke manier zou jij een eiwit uit dit mengsel opzuiveren? Motiveer je keuze. Wat gebeurt er tijdens de verschillende stappen met de eiwitten?
  • De purificatiefactor en de opbrengst berekenen
  • Geef 1 manier hoe je de concentratie van een eiwit kan bepalen en leg deze uit
  • Een chromatogram gegeven: van welke scheidingstechniek is dit? Verklaar.
  • Het resultaat van een iso-elektrische focussering linken met het gegeven chromatogram
  • Discontinue SDS-Page en isotachoforese: het verschil tussen de 2 stacking en resolving gel uitleggen + wat er gebeurt met het eiwit. Waarom wordt dit gedaan?
  • Begrippen verklaren: CHAPS, DTT, Threonine, Tris


EIWITTECHNOLOGIE JUNI 2016

  • Een mengsel eiwitten gegeven, met van elk eiwit de AZ samenstelling, oplosbaarheid in (NH4)2SO4 en hydrofobiciteit gegeven. Op welke manier zou jij een eiwit uit dit mengsel opzuiveren? Motiveer je keuze. Wat gebeurt er tijdens de verschillende stappen met de eiwitten?
  • Vraag over Tris-buffer: volledige naam + structuur geven, berekening voor het maken van de buffer indien tris-base gegeven is, bereidingswijze + bewaring, voor- en nadelen, invloed bij verdunnen van de gemaakte buffer
  • Het gedrag van eiwitten in een anionenwisselaar + van 3 AZ'en bepalen in welke volgorde deze uit kolom komen
  • Chromatogram gegeven: van welke techniek? Hoe gebeurt elutie? Toepassingen
  • Situeer/verklaar begrippen: BCA, ramachandranplot, isotachoforese, CHAPS, elktroëndosmose


DNA Technologie Januari 2018

Vraag 1:

  • OLA-PCR (oligonucleotide ligation assay) en ASO (allele-specific oligonucleotide) primers: primers opstellen, tekenen van principe en elektroferogram
  • Leg fenol-chloroform extractie uit
  • enkele kleinere vraagjes, bijvoorbeeld is de gegeven mutatie transversie of transitie?

Vraag 2:

  • Gateway Clonase
  • His-tag opzuivering

Vraag 3:

  • fragmenten van dideoxy sequencing
  • teken elektroferogram CGE en pyrogram van pyrosequencing

Vraag 4:

Yeast-two hybrid: benoemen van figuur en kort uitleggen

Vraag 5:

Methode en toepassing verbinden

  • DNase Footprinting
  • Gel Mobility Shift Assay
  • Southern Blot
  • Northern Blot
  • Run off transcriptie
  • Primer extensie

foto's van resultaten van de technieken herkennen DNase footprinting uitleggen

Januari 2017

SCHRIFTELIJK

Vraag 1:

Je krijgt een agarose gel en een CGE van 2 rRNA stalen. (p55 cursus)

- Hierin moet je aanduiden waar 23S en 16S zit

- De assen benoemen van CGE

- Hoe werkt de detectie hiervan?

- De ratio van 23S/16S = 2 wat wil dit zeggen?

- Hoe rRNA’s uit het extract verwijderen?


Vraag 2:

YAC4 (je krijgt de afbeelding)

- welk gen dient voor ... (van alle genen in de YAC vector weten waarvoor ze dienen)

- De gist gastheer is mutant in een gen, waardoor er geen adenosine synthese meer is.

o Gevolg voor transmutatanten, klonering,…

o Moet de gistcel auxotroof of prototroof zijn voor histidine, tyrosine en uracil? Leg uit

o Is de gist SUP4+ / SUP4-? Leg verband met de screening. (Uitleggen van insertionele inactivatie en positieve selectie door wit-rood screening)


Vraag 3:

Je moet een insert van een bepaalde grootte in een vector kloneren. Vector is gegeven met uitstekende T einden en TOPO hangt eraan. Zo weinig mogelijk mutaties en ‘achtergrond’ artefacten. Lijst met verschillende polymerasen en hun verschillende eigenschappen gegeven.

Welk polymerase zou je kiezen? En leg uit waarom. (vb. van eigenschappen: extendase is belangrijk voor Topo T/A ligatie, proofreading is beter dan geen proofreading, hotstart polymerase is beter dan zonder hotstart, polymerase moet de grootte van het insert aankunnen...)

- Vector bevat 3 ori’s: pUC ori, f1 ori, SV 40 ori. Wat is hun functie.

- Op wat baseert de klonering zich en leg uit. (Topo T/A uitleggen)

- Wat doet de 6x HIS?


Vraag 4:

Je krijgt een vector met alles erop. Insertie in de MCS. Hierin wilt men erase-a-base toepassen

- Welke RE zou je nemen (lijst van RE) (er moet dus gekozen worden voor een 5' overhang aan de kant van het insert en een 3' overhang aan de andere kant)

- In welke volgorde komen deze bewerkingen voor in het proces? 2xRE, Exonuclease, S1 nuclease, DNA pol, DNA ligase,

Je krijgt een paar boxen zoals p375. Welke box is wat?

- een enhancer

- een silencer

- geen functie


Hoe werkt het?

Luciferase uitleggen

Wat is de functie van het pGL3 construct ?


Vraag 5:

Twee sequenties gegeven. Een van beide sequenties is homozygoot (...A...) voor een SNP, de andere is heterozygoot (...A/G...) voor deze SNP.

- Voor wat staat SNP?

- Teken een pyrogram van beide sequenties

- Voor wat staat: RT-PCR en HRM?

- Leg uit hoe de detectie van RT-PCR werkt en hoe HRM hier verder uit kan gaan?

- Teken de grafiek van HRM van deze twee sequenties en van een derde sequentie die homozygoot is voor (...G...), leg uit


Vraag 6:

3 foto's van audiogrammen, welke techniek is te zien op welke foto en verklaar deze?

- EMSA

- DNase footprinting

- Primer extensie op RNA

- Southern/northern

Januari 2015

Mondeling

Wat is het verschil tussen een cDNA bank en een gDNA bank? Aan de hand van een casus zeggen welke bank je zou kiezen + helemaal uitleggen hoe je die maakt

EMBL3 vector, wat voor een vector is dit? De gebruikte gastheer is spi+, wat betekent dit?


Schriftelijk

Oefening met restrictie enzymen

Yeast two hybrid systeem uitleggen adhv een gegeven figuur

Wat betekent FRET? Taqman probes uitleggen en FRET hierbij toepassen

Wat is LIF? Hoe gebeurt de detectie? Wat moet je met het staal doen zodat het kan gedetecteerd worden?

Vragen over CGE en STR detecties

Januari 2012

Mondeling

  • S1 mapping uitleggen
  • Bank voor het gen bepalen
  • Uitleggen hoe dat de beide banken gemaakt worden (beknopt)
  • Welke soort vectoren worden er gebruikt voor deze inserten?
  • S1 mapping helemaal uitleggen + zelf een tekening maken
  • Probe labeling van de probe die gebruikt wordt
  • Foto van de gelelektroforese uitleggen
  • Lengte van het fragment geven (ladder is gegeven)

Schriftelijk

1) RNA synthese:

   - Vraagjes over welke denaturerende agentia gebruikt mag worden en welke niet
   - Een foto van een gelelektroforese uitleggen
   - LIF en CGE uitleggen
   - ... nog een paar kleine vraagjes over RNA dingen

2) Oefeningen op RE

3) PCR:

   - Welke PCR methode wordt gebruikt om ziekte van Duchenne te diagnosticeren (= veel deleties op het gen)?
   - .................................... sikkelcel anemie te diagnosticeren (= SNP)?
   - Verschil tussen hybridisatie PCR en Taqman PCR (= FRET methode)

4) Pyrosequencing uitleggen.

5) YAC-vector uitleggen + rood-wit screening

6) GMO's:

   - Op welk enzym werkt 'RoundUp'
   - Positieve en negatieve screening uitleggen (die van in het hoofdstuk van GMO's)
   - ... nog een paar kleine vraagjes

2011-2012

Januari

Mondeling

Gegeven een figuur

  • expressie van één gen? Via Northern blotting (expressie van 1 RNA)
  • bepalen van 5’? via 5’ RAcE.
  • Bepalen van de +1 start transcriptie startplaats
  • Hoe gebeurd de labeling?

Schriftelijk

  1. uitleggen van LIF en capillaire elektroforese?
  2. IEF en 2dim PAIGE
  3. Oefeningen van restrictie-enzymen: invoegen van een insert + hoe dit gebeurd (blunt/sticky: geforceerd of niet) + terug uithalen van het insert…
  4. YAC-vector: invuloefening voor onderdelen van de vector + de wit/rood kleuring uitleggen.
  5. Sequencing uitleggen (nl. dideoxysequencing) + welk soort labeling en in welk soort agar dit gebeurd.

Augustus

Mondeling

Gegeven een figuur

  • Tekstje van vlieg: je wilt hieruit het gen selecteren.
  • Welke soort vector: insertie of substitutievector
  • Welke bank (genenbank of cDNA bank); verklaar beide en leg uit welke je wil gebruiken
  • Hoe maak je het insert aan? Dus via welke bank
  • hoe gebeurt de selectie in deze vector: via spi (uitleggen)
  • werking van deze vector uitleggen

Schriftelijk

  1. techniek van erase-a-base uitleggen adh van tekening (puntjes verder aanvullen) + waarvoor wordt deze techniek gebruikt.
  2. Oefeningen van restrictie-enzymen: invoegen van een insert in een vector + hoe dit gebeurd (blunt/sticky: geforceerd of niet) + terug uithalen van het insert met RE (zelfde oefening als in januari!)
  3. HOT start PCR: leg deze techniek uit en welke 2 methodes worden hiervoor gebruikt. Wat is het voordeel van deze techniek? Leg ook uit: RAPF en PFLP
  4. Sequencing uitleggen (nl. dideoxysequencing) + welk soort labeling en in welk soort agar dit gebeurd adh van een gegeven matrijs.